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HJ 1069-2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法

1 适用范围

      本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。

      本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。

2 规范性引用文件

      本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件,其有效版本适用于本标准。

      GB/T 6920 水质 pH 值的测定 玻璃电极法

      GB/T 13267 水质 物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法

      HJ 91.1 污水监测技术规范

      HJ 506 水质 溶解氧的测定 电化学探头法

      HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范

      HJ/T 164 地下水环境监测技术规范

3 术语和定义

      下列术语和定义适用于本标准。

3.1

      鱼卵 fish egg

      指处于卵膜破裂前整个发育阶段的卵细胞,斑马鱼卵相关发育阶段参见附录 A

3.2

      稀释倍数 dilution level

      原水样占稀释后水样总体积分数的倒数,一般用 D 来表示。例如,水样未稀释,则稀释倍数 D=1;取 250 ml 水样稀释至 1000 ml(即体积分数为 25%),则稀释倍数D=4

3.3

      最低无效应稀释倍数 lowest ineffective dilution

      测试中不产生测试效应的最低稀释倍数,本标准指不少于 90%鱼卵存活时水样的最低稀释倍数,用 LID 表示。

3.4

      半数效应浓度 EC50

      指暴露48 h 后使50%斑马鱼卵产生效应的原水样占稀释后水样总体积的百分数,用EC50表示。本标准中 EC50 即半数致死浓度 LC50

3.5

      参比物质 reference substance

      测试中,用于验证方法敏感性的已知阳性对照物质,如本标准中 3,4-二氯苯胺。

4 方法原理

      使用多孔细胞培养板,在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下,将 4-细胞期~128-细胞期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中,在 26℃±1℃的条件下培养 48 h,根据鱼卵存活与死亡的统计数据计算 LID EC50 值,表征水样的急性毒性。

5 干扰和消除

      水样浊度或色度干扰测试终点判断,可用塑料滴管(7.11)缓慢从多孔细胞培养板(7.8) 中吸出一定量的水样后再行观测,避免触碰鱼卵;观测结束后,若需继续暴露,则用塑料滴管(7.11)将原水样移回,恢复原有暴露体积。

6 试剂和材料

6.1 受试生物

6.1.1 种鱼

      使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长 3.5 cm 左右,鱼龄在 6 月~24 月之间。健康雌鱼腹部银亮,饱满膨大。健康雄鱼体型修长,腹部扁平,身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前 6 个月不予使用任何药物。种鱼驯养及维持具体条件见附录 B

6.1.2 鱼卵

      确保试验鱼卵受精率70%,处于 4-细胞期~128-细胞期(见附录 A)。

6.2 试剂

      除非另有说明,分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去离子水,满足 pH 6.58.5,电导率<10 μS/cm 的要求。

6.2.1 氢氧化钠(NaOH)。

6.2.2 氯化钙(CaCl2·2H2O)。

6.2.3 硫酸镁(MgSO4·7H2O)。

6.2.4 碳酸氢钠(NaHCO3)

6.2.5 氯化钾(KCl)。

6.2.6 3,4-二氯苯胺(C6H5Cl2N),优级纯。

6.2.7 盐酸:ρ(HCl=1.19 g/ml

6.2.8 盐酸溶液:cHCl=0.1 mol/L

      量取 8.3 ml 盐酸(6.2.7),用水定容至 1 000 ml

6.2.9 氢氧化钠溶液:cNaOH=0.1 mol/L

      称取 4 g 氢氧化钠(6.2.1),溶于少量水中,用水定容至 1 000 ml

6.2.10 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液:ρ(C6H5Cl2N=100 mg/L

      称取 0.05 g 3,4-二氯苯胺(6.2.6),溶于少量标准稀释水(6.2.16)中,用标准稀释水(6.2.16)定容至 500 ml,静置 24 h,调节 pH 值至 7.0。避光冷藏保存,储备液可储存 6 个月。

6.2.11 参比物质 3,4-二氯苯胺工作液:ρ(C6H5Cl2N=3.7 mg/L

      量取 3.7 ml 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液(6.2.10),用溶解氧浓度达空气饱和值的标准稀释水(6.2.16)定容至 100 ml,使用前按 8.2.1 步骤平衡至 26℃±1℃。该溶液作为阳性对照,临用前现配。

6.2.12 氯化钙储备液:ρ(CaCl2·2H2O=11.76 g/L

      称取 11.76 g 氯化钙(6.2.2),溶于少量水中,用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.13 硫酸镁储备液:ρ(MgSO4·7H2O=4.93 g/L

      称取 4.93 g 硫酸镁(6.2.3),溶于少量水中,用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.14 碳酸氢钠储备液:ρ(NaHCO3=2.52 g/L

      称取 2.52 g 碳酸氢钠(6.2.4),溶于少量水中,用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.15 氯化钾储备液:ρ(KCl=0.22 g/L

      称取 0.22 g 氯化钾(6.2.5),溶于少量水中,用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.16 标准稀释水。

      将氯化钙储备液(6.2.12)、硫酸镁储备液(6.2.13)、碳酸氢钠储备液(6.2.14)和氯化钾储备液(6.2.15)四种储备液各 25 ml 混合,用水定容至 1 000 ml

7 仪器和设备

7.1 冷藏采样箱:2℃~8℃;

7.2 pH 计:测量范围 014,最小分度为 0.1 pH 单位;

7.3 溶解氧测定仪:测量范围 0 mg/L20 mg/L,最小分度为 0.1 mg/L

7.4 倒置显微镜或体视显微镜:最小放大倍数为 30×;

7.5 冰箱:冷藏室 2℃~8℃;冷冻室≤-18℃;

7.6 恒温培养箱或恒温室:温度可调至 26℃±1℃;

7.7 斑马鱼养殖系统:包括净水、储水、供水、水质控制及循环等系统;

7.8 多孔细胞培养板:每孔容积 2.5 ml5 ml 或采用其它相同功能的细胞培养板,可选择市售;

7.9 产卵盒:惰性材料,推荐尺寸:20 cm×10 cm×11 cm(参见附录 C),可选择市售;

7.10 温度计:0℃~50℃;

7.11 塑料滴管:5 ml,口径大于 3 mm

7.12 一般实验室常用器皿和设备。

8 样品

8.1 样品的采集和保存

      根据样品性质及监测需要使用 1 000 ml 及以上容量的棕色玻璃瓶(或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器)按照HJ 91.1HJ/T 91 HJ/T 164 的要求进行水样的采集,水样沿瓶内壁缓慢倒入,并与瓶塞间不留空隙。

      水样采集后,立即于 2℃~8℃避光运输和保存,并尽快进行试验,保存时间最长不超过 48 h。水样若需长期保存,则上述水样采集后应尽快送回实验室冷冻(≤-18℃)保存, 保存前将水样充分混匀后按每 1000 ml 容器盛装 500 ml700 ml 水样的量分装,保存期不超过 2 个月。

8.2 样品预处理

8.2.1 温度

      冷冻保存的水样需在不超过 25℃水浴轻微振荡解冻,或在 2℃~8℃冷藏过夜解冻。受试水样在试验开始前,放置于恒温培养箱或恒温室(7.6)中,26℃±1℃避光平衡至恒温后用于试验。

8.2.2 pH

      按照 GB/T 6920 方法测定水样 pH 值。当 pH 值<6.5 pH 值>8.5 时,使用盐酸溶液(6.2.8)或氢氧化钠溶液(6.2.9)调节水样 pH 值至 6.58.5,尽量减少酸碱调节液的用量, 以减少对水样浓度的影响。测定并记录调节后的水样 pH 值,按后续步骤进行水样测定。

      当 pH 值的影响需要反映在试验结果中或者调节 pH 值会引起水样物理变性或化学反应时,则不调节水样 pH 值。

根据水样测定的实际需求,也可对 pH 值调节前后的水样同时开展试验比较。

8.2.3 溶解氧

      按照 HJ 506 方法测定水样溶解氧浓度,确保用于暴露试验(9.3)步骤中的每个稀释水样中初始溶解氧浓度不低于 4 mg/L(大约 50%饱和度)。若要充氧,溶解氧浓度不超过相应饱和溶解氧值。

8.3 样品稀释

8.3.1 预实验

      当浓度难以预估时需进行预试验,以稀释比为 10 选择 3 个连续浓度的稀释水样,每一浓度以 5 粒鱼卵按 9.39.6 部分进行试验,以确定鱼卵死亡率 100%0%与稀释水样浓度大致对应的范围。

 

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